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T4多聚核苷酸激酶(3’磷酸酶活性缺失)

產品編號 產品名稱 規格 價格(元) 說明書
C5002A T4多聚核苷酸激酶 200U 600
C5002B 2,000U 4,000
T4多聚核苷酸激酶能夠催化ATP的 γ-位磷酸基團轉移到寡核苷酸鏈(雙鏈或單鏈DNA或RNA)的 5’-羥基末端以及3’-單磷酸核苷上。T4 多聚核苷酸激酶還具有3’磷酸酶活性,將3’-磷酸基團從寡核苷酸的3’磷酸末端、脫氧3’-單磷酸核苷和脫氧3’-二磷酸核苷上水解掉。該酶經修飾后,其3’磷酸酶活性缺失,但仍保留了所有激酶的活性。

組分

組分名稱 數量
T4 Polynucleotide Kinase (10 U/μl) 20 μl/200 μl
10×T4 PNK Buffer 1 ml/1 ml×2
10mM ATP 100 μl/500 μl

應用

  • DNA 或 RNA 5′ 末端的磷酸化,以便進行連接反應。
  • DNA 或 RNA 的末端標記,用作探針和進行 DNA 測序
  • 將 3′ 端已經磷酸化的單核苷酸 5′ 磷酸化,制備pNp 底物,用于添加到 DNA 或 RNA的 3′ 端
  • 對 3′ 端有磷酸基團的寡核苷酸的 5′ 端進行標記
  • 活性定義

    1 單位指 37℃條件下,30 分鐘內催化1nmol 酸不溶性[32P] 摻入所需要的酶量。

    儲存

    -20℃可保存3年。

    使用注意事項

    (1)1× T4 多聚核苷酸激酶反應緩沖液:70 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM MgCl2,5 mM DTT,37℃ 溫育。
    (2)熱失活:65℃ 加熱 20 分鐘。
    (3)在放射性標記實驗中,可用 1× T4 多聚核苷酸激酶反應緩沖液、50pmol的γ-[32P] ATP和20單位的酶37℃溫育30分鐘。
    (4)T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能發揮活性,但是為了適用于高活力的放射性標記反應,在隨酶提供的反應緩沖液中不含ATP。因此在磷酸化修飾核酸時請單獨添加終濃度0.5~1mM ATP。
    (5)要提高平齊末端或5’凹陷末端的磷酸化效率,可在加入T4多聚核苷酸激酶前,先將DNA溶液于70℃加熱5分鐘,然后冰上冷卻,并加入5%(W/V)的PEG-8000。
    (6)一般來說,進行激酶反應之后是連接反應。在這種情況下,T4多聚核苷酸激酶反應在連接酶反應緩沖液中37℃ 溫育30分鐘即可。反應后的產物可直接進行連接,無需改變緩沖液和進行熱失活。如果連接時需要保持其它DNA片段的去磷酸化狀態,則需要在連接反應前熱失活T4多聚核苷酸激酶。
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